BIO K 264/2 Multiscreen AgELISA VHSV-IHNV / sandwich, double wells

Вирусная геморрагическая септицемия (VHS) — это заболевание разводимой на ферме радужной форели, тюрбо, разводимой на ферме японской камбалы, а также нескольких диких пресноводных и морских видов, вызываемое рабдовирусом VHSV. Заболевание обычно возника-ет при температуре от 4°C до 14°C. При температуре воды от 15°С до 18°С болезнь обычно про-текает непродолжительно с умеренной накопленной смертностью. Заболевание редко возникает при более высоких температурах. VHS выход.
Клиническими признаками болезни являются высокая смертность (у мальков может до-стигать 100 %), особенно в первую зимовку молоди форели. Субъекты проявляют вялость, мела-ноз и экзофтальм. Бледность их жабр отражает их анемичное состояние. На вскрытии обнаружи-вают наличие многочисленных очагов кровоизлияний во внутренние органы и мышечные массы, вздутие живота за счет отека в брюшной полости. VHS также может возникать в нервной форме, характеризующейся тяжелым аномальным поведением при плавании, таким как постоянное вспыхивание и / или спиральное движение.
IHN — вирусное заболевание, вызываемое рабдовирусом. Поражает большинство видов лососевых, особенно мальков и молодь. К восприимчивым видам относятся: радужная или стальноголовая форель (Oncorhynchus mykiss), кумжа (Salmo trutta). Тихоокеанский лосось, включая чавычу (O. tshawytscha), нерку (O. nerka), кету (O. keta), симу (O. masou) и кижуча (O. kisutch), а также атлантического лосося (Salmo salar).
Клиническая форма заболевания обычно возникает в воде при температуре от 8 до 15°C. Для него характерны расстройства нервной системы и пищеварения: чередование апатии и судо-рожных движений, потемнение кожных покровов, бледность жабр и вздутие живота. Об энтерите свидетельствуют длинные беловатые экскременты. На вскрытии обнаруживают экзофтальмию, асцит и кровоизлияния в мышечную массу и внутренние органы. Печень, почки и селезенка бледные. Смертность, связанная с вирусом, может быть высокой. Практически невозможно от-личить IHN от VHS только на основании клинических данных. Дифференциальный диагноз, по-лученный лабораторным исследованием, таким образом, представляется необходимым.
Тест VHS-IHN ELISA подтверждает рост вируса на восприимчивой клеточной линии.

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТЕСТА
Золотым стандартом для выявления IHNV и VHSV является выделение вируса в культуре клеток с последующей его иммунологической или молекулярной идентификацией. Инфициро-ванные образцы полностью гомогенизируют (с помощью желудокера, блендера или ступки и пе-стика со стерильным песком) и затем суспендируют в культуральной среде с добавлением анти-биотиков. Препарат центрифугируют и 24-луночный планшет для культивирования клеток ино-кулируют серийными разведениями супернатанта. Через 1 час инкубации при оптимальной тем-пературе в каждую лунку добавляют питательную среду и планшет инкубируют до появления цитопатогенного эффекта. В этот момент пластина застывает. Он готов к тестированию методом ИФА. В тесте используются 96-луночные микротитровальные планшеты, сенсибилизированные специфическими антителами к вирусам VHS и IHN. Ряды A и E были сенсибилизированы анти-VHSV, ряды C и G - анти-IHNV, а ряды B, D, F, H содержат неспецифические антитела. Эти кон-трольные ряды позволяют различать специфические иммунологические реакции и неспецифиче-ское связывание, чтобы исключить ложноположительные результаты.
Супернатанты инкубируют на микропланшете в течение 1 часа при 21°С +/- 3°С.
После этой первой стадии инкубации планшет промывают и инкубируют в течение 1 часа с конъюгатами, мечеными пероксидазой специфическими моноклональными антителами против VHSV и против IHNV. После этой второй инкубации планшет снова промывают и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). Этот хромоген имеет то преимущество: он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не является канцерогенным.
Если VHSV или IHNV присутствуют в супернатанте клеточной культуры, конъюгаты остаются связанными с соответствующими микролунками, и фермент катализирует превращение бесцветного хромогена в пигментированное соединение. Интенсивность полученного синего цвета пропорциональна титру VHSV или IHNV в супернатанте. Ферментативную реакцию можно остановить подкислением и полученную оптическую плотность при 450 нм записывают с помо-щью фотометра. Сигналы, записанные для микролунок отрицательного контроля, вычитают из соответствующих микролунок положительного контроля. Контрольный антиген предоставляется вместе с набором для подтверждения результатов теста.