BIO K 272/2 Monoscreen AgELISA VHSV / sandwich, double wells

Вирусная геморрагическая септицемия (VHS) — это заболевание характерное разводимой на ферме радужной форели, тюрбо, японской камбалы, а также нескольких диких пресноводных и морских видов, вызываемое рабдовирусом VHSV. Заболевание обычно развивается при темпе-ратуре от +4°C до +14°C. При температуре воды от +15°C до +18°C болезнь обычно протекает непродолжительно с умеренной смертностью. Заболевание редко появляется при более высоких температурах. Вспышки VHS происходят в любое время года, но чаще всего весной, когда тем-пература воды повышается или колеблется.
Признаками болезни являются вялость, меланоз и экзофтальм. Бледность их жабр отра-жает их анемичное состояние. На вскрытии обнаруживают наличие многочисленных очагов кро-воизлияний во внутренние органы и мышечные массы, вздутие живота за счет отека в брюшной полости. VHS также может возникать в нервной форме, характеризующейся тяжелым аномаль-ным поведением при плавании, напр. спиральное движение. VHS можно отличить от инфекцион-ного гемопоэтического некроза (IHN) — другой вирусной инфекции лососевых, также вызывае-мой рабдовирусом, — только на основании клинического обследования. Таким образом, диффе-ренциальный диагноз необходимо проводить в лаборатории.
Тест VHSV AgELISA подтверждает рост вируса на восприимчивой клеточной линии.

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТЕСТА
Лучшим методом выявления VHSV является выделение вируса в культуре клеток с по-следующей его иммунологической или молекулярной идентификацией. Анализируемые образцы полностью гомогенизируют (с помощью желудокера, блендера или ступки и пестика со стериль-ным песком) и затем суспендируют в культуральной среде с добавлением антибиотиков. Препа-рат центрифугируют и инокулируют 24-луночный планшет для культивирования клеток серий-ными разведениями супернатанта. Через 1 час инкубации при оптимальной температуре в каж-дую лунку добавляют питательную среду и планшет инкубируют до появления цитопатогенного эффекта. Затем планшет замораживают. После этого он готов к тестированию методом ИФА. В тесте используются 96-луночные планшеты для микротитрования, сенсибилизированные специ-фическими антителами к вирусу VHS. Ряды A, C, E, G были сенсибилизированы этими антитела-ми, а ряды B, D, F, H содержат неспецифические антитела. Эти контрольные ряды позволяют различать специфические иммунологические реакции и неспецифическое связывание, чтобы ис-ключить ложноположительные результаты.
Супернатанты инкубируют на микропланшете в течение 1 часа при 21°С±3°С.
После этой первой стадии инкубации планшет промывают и инкубируют в течение 1 часа с конъюгатом, меченым пероксидазой моноклональным антителом против VHSV. После второй инкубации планшет снова промывают и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). Этот хромо-ген имеет преимущество: он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не явля-ется канцерогенным.
Если VHSV присутствует в супернатанте клеточной культуры, конъюгат остается связан-ным с соответствующими микролунками, а фермент катализирует превращение бесцветного хромогена в пигментированное соединение. Интенсивность полученного синего окрашивания пропорциональна титру VHSV в супернатанте. Ферментативную реакцию можно остановить подкислением и полученную оптическую плотность при 450 нм измеряют с помощью фотомет-ра. Сигналы, полученные для микролунок отрицательного контроля, вычитают из соответству-ющих микролунок положительного контроля. Положительный контрольный антиген поставляет-ся с набором для подтверждения результатов теста. Этот набор не дает перекрестных реакций с IHNV.