BIO K 273/2 Monoscreen AgELISA IHNV / sandwich, double wells

Инфекционный гемопоэтический некроз (INH) — вирусное заболевание, вызываемое раб-довирусом. Поражает большинство видов лососевых, особенно мальков и молодь. Восприимчи-вые виды включают радужную или стальноголовую форель (Oncorhynchus mykiss) и кумжу (Salmo trutta); тихоокеанские лососи, включая чавычу (O. tshawytscha), нерку (O. nerka), кету (O. keta), симу (O. masou) и кижуча (O. kisutch); и атлантический лосось (Salmo salar).
Заболевание иногда вызывает чрезвычайно большие экономические потери, будь то прес-новодные популяции или морское рыболовство. Клиническая форма заболевания обычно возни-кает в воде при температуре от 8 до 15°C. Для него характерны расстройства нервной системы и пищеварения: чередование апатии и судорожных движений, потемнение кожных покровов, блед-ность жабр и вздутие живота. Об энтерите свидетельствуют длинные беловатые экскременты. На вскрытии обнаруживают экзофтальм, асцит и кровоизлияния в мышечную массу и внутренние органы. Печень, почки и селезенка бледные. Заболевание почти невозможно отличить от вирус-ной геморрагической септицемии (VHS), другой вирусной инфекции лососевых, также вызывае-мой рабдовирусом, только на основании клинических данных. Дифференциальный диагноз, по-лученный лабораторным исследованием, таким образом, представляется необходимым.

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТЕСТА
Золотым стандартом выявления IHNV является выделение вируса в культуре клеток с по-следующей его иммунологической или молекулярной идентификацией. Инфицированные образ-цы полностью гомогенизируют (с помощью желудокера, блендера или ступки и пестика со сте-рильным песком) и затем суспендируют в культуральной среде с добавлением антибиотиков. Препарат центрифугируют и 24-луночный планшет для культивирования клеток инокулируют серийными разведениями супернатанта. Через 1 час инкубации при оптимальной температуре в каждую лунку добавляют питательную среду и планшет инкубируют до появления цитопатоген-ного эффекта. В этот момент планшет застывает. Он готов к тестированию методом ИФА. В те-сте используются 96-луночные планшеты для микротитрования, сенсибилизированные монокло-нальными антителами, специфичными к вирусу IHN. Ряды A, C, E, G были сенсибилизированы этим антителом, а ряды B, D, F, H содержат неспецифические антитела. Эти контрольные ряды позволяют различать специфические иммунологические реакции и неспецифическое связывание, чтобы исключить ложноположительные результаты. Образцы разводят лизисным раствором и инкубируют на микропланшете в течение 1 часа при 21°С±3°С.
Супернатанты инкубируют на микропланшете в течение 1 часа при 21°С±3°С.
После этой первой стадии инкубации планшет промывают и инкубируют в течение 1 часа с конъюгатом, меченым пероксидазой моноклональным антителом против IHNV. После второй инкубации планшет снова промывают и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). Этот хромо-ген имеет преимущество: он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не явля-ется канцерогенным.
Если IHNV присутствует в супернатанте клеточной культуры, конъюгат остается связан-ным с соответствующими микролунками, а фермент катализирует превращение бесцветного хромогена в пигментированное соединение. Интенсивность полученного синего окрашивания пропорциональна титру IHNV в супернатанте. Ферментативную реакцию можно остановить под-кислением и полученную оптическую плотность считывают с помощью фотометра на длине волны 450 нм. Сигналы, записанные для микролунок отрицательного контроля, вычитают из со-ответствующих микролунок положительного контроля. Положительный контроль предоставля-ется вместе с набором для подтверждения результатов теста.
Этот тест не дает перекрестной реакции с VHSV.