BIO K 282/2 Monoscreen AgELISA IPNV / sandwich, double wells

Вирусная этиология инфекционного панкреонекроза (IPN) была доказана Wolf et al. (1960). Выделяют три основные группы вирусов IPN: ATCC VR 299 (Wolf et al., 1968), Ab и Sp (Vestergard-Jorgensen and Kehlet, 1971). Эти три группы отличаются своими реакциями серонейтрализации, способностью расти на различных линиях клеток рыб и патогенностью. Вирусы IPN гораздо более устойчивы к различным физико-химическим условиям окружающей среды, чем другие вирусы Salmonidae, такие как VHS. Инфекция вызывает смертность мальков в различном возрасте (Dorson and Torchy, 1981). Признаками болезни являются своеобразное поведение во время плавания, характеризующееся вращением вокруг горизонтальной оси, вздутием живота, особенно заметным в области желудка, и заполненным слизью пищеварительным трактом (Wood et al., 1955). Хотя вирус IPN в первую очередь патогенен для некоторых мальков Salmonidae, Dorson et al. (1987) доказали восприимчивость мальков щуки (Esox lucius) к вирусу. Также к вирусу восприимчивы карпы, угри и др. Эти рыбы могут быть резервуарами и физическими переносчиками вируса IPN (Dorson, 1982).

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТЕСТА

Зараженные образцы растирают в ступке с помощью песка, затем помещают в раствор в питательной среде с добавлением антибиотиков. Также можно использовать измельчитель или блендер. Препарат центрифугируют и 24-луночный планшет для культивирования клеток инокулируют серийными разведениями супернатанта. Через 1 час инкубации при оптимальной температуре в каждую лунку добавляют питательную среду и планшет инкубируют до появления цитопатогенного эффекта. В этот момент пластина застывает. Он готов к тестированию методом ИФА. В тесте используются 96-луночные планшеты для микротитрования, сенсибилизированные специфическими моноклональными антителами к вирусу IPN. Ряды A, C, E, G были сенсибилизированы этими антителами, а ряды B, D, F, H содержат неспецифические антитела. Эти контрольные ряды позволяют различать специфические иммунологические реакции и неспецифическое связывание, чтобы исключить ложноположительные результаты.
Супернатанты инкубируют на микропланшете в течение 1 часа при 21°С±3°С.
После первой инкубации планшет промывают и инкубируют в течение 1 часа с конъюгатом, меченым пероксидазой специфичным поликлональным антителом против IPNV. После второй инкубации планшет снова промывают и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). Этот хромоген имеет преимущество: он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не является канцерогенным.
Если IPNV присутствует в супернатанте клеточной культуры, конъюгат остается связанным с соответствующими микролунками, а фермент катализирует превращение бесцветного хромогена в пигментированное соединение. Интенсивность полученного синего окрашивания пропорциональна титру IPNV в супернатанте. Ферментативную реакцию можно остановить подкислением и полученную оптическую плотность при 450 нм измеряют с помощью фотометра. Значения, полученные для отрицательного контроля, вычитают из соответствующих микролунок положительного контроля. Положительный контрольный антиген поставляется с набором для подтверждения результатов теста.