BIO K 368/2 Multiscreen AbELISA Bovine abortion / indirect, double wells

Задача определения причины выкидыша у крупного рогатого скота, как правило, доволь-но сложна, потому что в большинстве случаев это следствие события, произошедшего за не-сколько недель или месяцев до этого. Часто также плод остается в матке в течение нескольких часов или дней после его смерти, и, когда он наконец выходит, он подвергается аутолизу, таким образом, что трудно провести какой-либо анализ. Кроме того, многие причины выкидышей у крупного рогатого скота до сих пор неизвестны. Многие патогены редко ищут, потому что с ни-ми трудно или опасно рабоать (Coxiella burnetii, Chlamydia abortus). Возбудители, прямо или косвенно ответственные за выкидыши, многочисленны и разнообразны, что затрудняет диагно-стику. Среди основных возбудителей, вызывающих выкидыши, выделяют вирусы (BoHV-1, BVDV, BoHV-4), бактерии (Brucella abortus, Trueperella pyogenes, кишечную палочку, стрепто-кокки, Coxiella burnetii, Leptospira hardjo, Ureaplasma diversum, Campylobacter foetus, Borrelia coriaceae, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia abortus, Salmonella, Listeria monocytogenes et Haemophilus somnus), паразиты (Distoma hepatica, Trichomonas, Sarcocystis, Neospora), грибы (Aspergillus fumigatus, Mortierella wolfii, а также Mucor, Absidia, Rhizopus) и дрожжи (Candida).
Набор предназначен для определения сероконверсии по отношению к упомянутым выше патогенным агентам у взрослого крупного рогатого скота. Когда происходит выкидыш, сероло-гический титр коровы часто достигает своего максимума и сероконверсию показать невозможно. Таким образом, лучше проверять других животных стада, чтобы узнать, что предполагаемая ин-фекция активна. Если у большинства животных наблюдается четкая сероконверсия по отноше-нию к одному из пяти патогенов набора, можно отнести причину выкидыша к этому патогену.

ПРИНЦИП РАБОТЫ ТЕСТА

В тесте используются 96-луночные планшеты для микротитрования, сенсибилизирован-ные моноклональным антителом, специфичным к Neospora caninum. Это антитело используется для улавливания Neospora caninum, а также для его очистки от культур этого простейшего. Для Salmonella dublin и Leptospira hardjo планшет сенсибилизирован очищенным липополисахари-дом (LPS). После первой стадии инкубации планшет промывают и инкубируют в течение 1 часа с конъюгатом, меченым пероксидазой моноклональным антителом против BRSV. После второй инкубации планшет снова промывают и добавляют хромоген (тетраметилбензидин). Этот хромо-ген имеет преимущество: он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не явля-ется канцерогенным.
Для BoHV-4 планшет сенсибилизирован очищенным вирусом.
Для Coxiella burnetii планшет сенсибилизирован антигенным экстрактом фазы I и фазы II из клеток Coxiella burnetii.
Распределение этих возбудителей на микротитрационном планшете выглядит следующим образом:
Лунки 1 и 7: BoHV-4
Лунки 2 и 8: Neospora caninum
Лунки 3 и 9: Coxiella burnetii фазы I + II
Лунки 4 и 10: Дублинская сальмонелла
Лунки 5 и 11: Leptospira hardjo
Лунки 6 и 12: отрицательный контроль
Лунки 6 и 12 содержат одно моноклональное антитело. Использование такого контроля значительно снижает количество ложных результатов. Исследуемые сыворотки и плазма разбав-ляются 1:100 в соответствующем буфере и инкубируются на планшете в течение одного часа при 21°С±3°С. Планшет промывают и в лунки добавляют конъюгат, меченое пероксидазой монокло-нальное антитело против бычьего IgG1. Планшет повторно инкубируют при 21°С±3°С в течение 1 часа. После этой второй инкубации планшет промывают и добавляют хромоген (тетраме-тилбензидин). Преимущество этого хромогена в том, что он более чувствителен, чем другие хромогены пероксидазы, и не является канцерогенным. Если в исследуемых сыворотках присут-ствуют специфические иммуноглобулины, конъюгат остается связанным с соответствующей микролункой, а фермент катализирует превращение бесцветного хромогена в пигментированное соединение. Интенсивность полученного синего цвета пропорциональна титру специфического антитела в образце. Сигналы, записанные для микролунок отрицательного контроля, вычитают из соответствующих микролунок положительного контроля. Можно количественно оценить ре-активность неизвестного образца по шкале от 0 до +++++.