Хроматографические методы анализа

Хроматография – это лабораторный метод аналитической химии, который помогает разделять смеси из различных соединений. В этом методе вещество, которое необходимо отделить, сначала нужно растворить в растворителе, который называют подвижной фазой (ПФ). Подвижная фаза переносит разделяемую смесь веществ через неподвижную фазу. Поскольку различные компоненты смеси движутся с разными скоростями внутри подвижной фазы, компоненты разделяются вдоль неподвижной фазы в хроматографической колонке.

Классификация хроматографических методов

Хроматографические методы делят в зависимости от хроматографического слоя, физического состояния подвижной фазы и механизма разделения.

Классификация хроматографии по механизму разделения

В зависимости от характеристических параметров, которые используются для достижения разделения смесей, меняется механизм разделения. По механизму разделения хроматографию можно разделить на следующие виды:

• Ионообменная хроматография
• Эксклюзионная хроматография по размеру
• Адсорбционная хроматография в расширенном слое

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография основана на электростатических взаимодействиях между заряженными группами белка в аналите и сорбента неподвижной фазы. Матрица загружена ионами, заряд которых противоположен заряду белковых групп. Следовательно, белок приобретает сродство к матрице благодаря своим свойствам ионной связи. Эти белки затем отделяют от матрицы путем изменения pH, концентрации ионных солей или ионной силы буферного раствора. Поскольку положительно заряженные ионообменные матрицы адсорбируют отрицательно заряженные белки, их называют анионообменными матрицами, а поскольку отрицательно заряженные матрицы адсорбируют положительно заряженные белки, их называют катионообменными матрицами.

Изображение выше представляет собой схематическое изображение метода ионообменной хроматографии.

Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионную хроматографию также широко называют гель-проникающей хроматографией или молекулярно-ситовой хроматографией. Он основан на разделении макромолекул на основе их различий в размерах молекул. Материалы на основе декстрана используются для разделения в этом типе хроматографии. Этот процесс также можно использовать для определения молекулярной массы белков. В эксклюзионной хроматографии неподвижная фаза представляет собой столбик материала, содержащий покрытие из инертного вещества с мелкими порами.

Смесь аналитов, содержащая молекулы разного размера, представляющая собой подвижную фазу, непрерывно с постоянной скоростью пропускают через колонку с неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше пор, не могут проникнуть в гель и удерживаются в ограниченной области. Большие молекулы будут проходить через пространства между пористыми частицами и легко проходить через колонку. Мельчайшие молекулы диффундируют в поры и покидают колонку с пропорционально более длительным временем удерживания.

Декстран, агароза, полиакриламид и сефадекс G являются некоторыми часто используемыми покрытиями для колонки с неподвижной фазой. Сефадекс G – наиболее часто используемый материал.

Посмотрите на изображение ниже, чтобы увидеть схематическое представление этого метода.

Адсорбционная хроматография

Адсорбционная хроматография с расширенным слоем используется для прямого отделения белков от неосветленной сырой пробы. Восходящий поток уравновешивающего буфера сначала пропускают через отстоявшийся слой, чтобы дать ему возможность расшириться. Неочищенную смесь аналитов, которая представляет собой смесь примесей, клеток и остатков клеток, а также растворимых белков, затем пропускают вверх через расширенный слой.

Слой адсорбента удерживает целевые белки и позволяет элюировать частицы и загрязнения в фазе. Чтобы вызвать десорбцию целевого белка, элюирующий буфер меняют, продолжая поддерживать восходящий поток. Этого также можно достичь, просто изменив направление потока, после чего адсорбированные частицы могут осесть, а белки затем могут быть десорбированы элюирующим буфером.

Смотрите схематичное представление ниже:

Классификация хроматографии по физическому состоянию подвижной фазы

Хроматографический анализ также можно классифицировать по физическому состоянию используемой подвижной фазы. В хроматографии есть два типа подвижных фаз: жидкие и газообразные. Следовательно, существует два типа хроматографии, основанные на этом параметре:

• Газовая хроматография
• Жидкостная хроматография

Газовая хроматография

Газовая хроматография — распространенный аналитический метод, который используют для разделения и идентификации компонентов сложной анализируемой смеси. В этом методе смесь газов и паров (газа-носителя) пропускают через длинную узкую колонну, заполненную материалом неподвижной фазы (НФ), которая может быть жидкой или твердой. Эта колонка упакована внутри устройства. Эта неподвижная фаза обычно представляет собой жидкость, адсорбированную на поверхности инертного твердого тела. Несущая фаза состоит из таких газов, как гелий или азот. Вот почему ее часто называют «газо-жидкостной» хроматографией. По мере прохождения смеси через эту колонну ее компоненты по-разному взаимодействуют с неподвижной фазой, вызывая их разделение в зависимости от их физических или химических свойств.

Разделенные компоненты обнаруживают с помощью масс-спектрометра или другого детектора по мере их элюирования из колонки. Газовая хроматография может использоваться для анализа широкого спектра материалов, включая, среди прочего, неорганические соединения, лекарства и загрязнители окружающей среды. Это высокочувствительный и точный метод, который находит применение в исследованиях, промышленности и судебно-медицинской экспертизе.

Жидкостная хроматография

Этот тип хроматографии предполагает использование подвижной фазы, которая представляет собой жидкость. Его можно выполнять как на плоской поверхности, так и внутри колонки. Этот тип хроматографии можно далее разделить на множество типов, таких как жидкостная хроматография с обращенной фазой и жидкостная хроматография высокого давления, и это лишь некоторые из них.

Классификация хроматографии по форме хроматографического слоя

Планарная хроматография 

В планарной хроматографии материал неподвижной фазы распределяется тонким слоем на плоской поверхности, например стеклянной или пластиковой пластинке. Следовательно, он имеет плоскую форму. Этот тип хроматографии можно далее классифицировать как бумажную хроматографию, в которой используется определенный тип бумаги в качестве неподвижной фазы, и тонкослойную хроматографию, сокращенно называемую ТСХ.

Колоночная хроматография

Это наиболее распространенный тип хроматографии, при котором материал неподвижной фазы помещается в колонку. Частицы неподвижной фазы, которые являются твердыми, заполняются в трубку. Затем подвижную фазу, содержащую разделяемую смесь, добавляют в верхнюю часть колонны и позволяют ей течь по неограниченному открытому пути вниз по середине трубки. Этому потоку можно позволить возникнуть естественным путем за счет силы тяжести или вызвать его с помощью давления. Различные компоненты смеси взаимодействуют с материалом неподвижной фазы и разделяются по мере движения через колонку.